Nació en Lima el 30 de abril de 1586. 

Fue bautizada con el nombre de Isabel Flores de Oliva

Fue llamada Isabel en honor a su abuela Isabel Herrera, una mujer indígena de Huánuco. 

María de Oliva y Herrera se casó en Lima hacia 1575 con el arcabucero español Gaspar Flores, con quien tuvo 13 hijos. Doña María fue hilandera y costurera. Tenía un taller en su casa del barrio de Monserrate donde cosía y elaboraba diversas prendas con la ayuda de su hija Isabel.

Diversas fuentes señalan que era una mujer de carácter áspero y bastante gruñona.

Cuando murió Rosa, doña María proporcionó muchos testimonios sobre la vida y obra de su hija durante el proceso que condujo a su beatificación y canonización. En uno de ellos relata el episodio que provocó su cambio de nombre, de Isabel a Rosa: Ocurrió cuando era una bebé de tres meses y doña María en su cuna tan hermosa que "parecía que todo el rostro estaba hecho una rosa". Y entonces le dijo: "Yo te prometo hija mía, que, mientras vivas, de mi boca no has de oír otro nombre sino el de Rosa".

Don Gaspar Flores Nació en Cáceres, en la región de Extremadura, España, aunque no se cabe la fecha exacta. En su juventud debió emigrar a Puerto Rico y luego a Panamá. Se sabe que llegó al Perú como soldado del Pacificador Pedro de La Gasca. Estuvo en la batalla de Jaquijahuana (Cusco - 1548), y presenció la muerte de los famosos rebeldes Gonzalo Pizarro y Francisco de Carbajal.

Hacia 1575, cuando servía de arcabucero en la guardia del virrey Francisco de Toledo, se casó con María de Oliva Herrera, con quien tuvo 13 hijos. Varios murieron siendo todavía niños.

Don Gaspar consiguió el puesto de administrador de un obraje en Quives, camino de Canta, en la sierra de Lima. Ahí, junto a su familia, permaneció de 1596 a 1600. Este año todos regresaron a la Capital del Virreinato del Perú, y vivieron en una casa del barrio de Malambo, donde hoy se ubican el Santuario y la Iglesia de Santa Rosa de Lima

Creció en su casa natal del barrio de Monserrate. Desde su niñez se sintió atraída por la vida religiosa. Oraba, ayunaba y hacía sacrificios identificándose con la pasión de Cristo. Creía que así ayudaba a reparar los pecados de la humanidad.

De niña, sufrió una enfermedad que le imposibilitaba la movilidad de las piernas. Su madre quiso aliviarle con una receta local, cubriéndole las piernas con pieles de buitre, medida que finalmente agravaría los males de la pequeña, sufriéndolos en silencio.

A los diez años se trasladó con su familia a Quives (sierra de Lima), Aquí don Gaspar trabajó cinco años como administrador de un obraje de indígenas. En ese pueblo Rosa fue testigo del sufrimiento de los indígenas. y allí

A los 11 años recibió el sacramento de la confirmación de Santo Toribio de Mogrovejo (1538-1606). Santo Toribio de Mogrovejo era en ese entonces el Arzobispo de Lima y estaba en misión pastoral por la sierra de Lima.

De regreso en Lima, A los 15 años su hermano Hernando le ayudó a construir una ermita de adobe en el patio de su casa. Aquí oraba, meditaba y cantaba alabanzas a Dios, Jesús y la Virgen María. y a los 20 se hizo Terciaria del Convento de Santo Domingo y pasó a llamarse Rosa de Santa María. Vistió hábitos blanquinegros, pero no hizo vida conventual. Fue devota de Santa Catalina de Siena, y así como ella mortificaba su cuerpo con castigos y penitencias.